مطالب آموزشی

كشت سلول و بافت گياهي

مقدمه

وقتي درباره كشت گياه صحبت مي شود معمولاً منظور كشت گياهان در گلدان، زيرپلاستيك، گلخانه و يا مزرعه مي باشد.

تكثير رويشي كه شامل قلمه زدن، خوابانيدن و پيوند زدن مي باشد.

از ديرباز در كشاورزي اهميت داشته و از آن در تكثير گياهان زراعي، درختان ميوه و … استفاده مي شود.

البته روشهاي تكثير رويشي در شرايط طبيعي در برخي موارد كارآمد نبوده.

روش جديدي از كشت گياهان، تحت عنوان كشت سلول و بافت گياهي معرفي و ارائه شده است.

كشت سلول و بافت گياهي كه با عنوان كشت درون شيشه ( invitro) و يا كشت استريل نيز مطرح مي شود.

در مورد تمام انواع كشت هاي استريل كه در شرايط درون شيشه اي انجام مي گيرد ، به كار مي رود.

در حال حاضر تكنيكهاي كشت بافت به عنوان ابزاري قوي جهت مطالعه مشكلات اساسي و كاربردي بيولوژي گياهي در آمده است.

 

علاوه برآن در سالهاي اخير اين تكنيك ها كاربردهاي تجاري گسترده اي در تكثير گياهان مختلف از جمله گياهان زينتي و دارويي و نيز حذف عوامل بيماريزا از گياهان پيدا نموده است.

علاقه مندي به كشت بافت و توانايي آن در اصلاح گياهان به صورت يك موضوع جهاني درآمده است.

افزايش تعداد كشورهاي عضو شركت كننده در موسسه بين المللي كشت بافت گياهي گواهي براين ادعا مي باشد .

علاوه بر آن هيئت بيولوژي گياهي موسسه تحقيقات سلولي يونسكو (ICRO)

آموزش تكنيك هاي كشت سلول و بافت گياهي را به عنوان يكي از برنامه هاي اولويت دار خود معرفي كرده است

تدريس تكنيك هاي كشت بافت جزو برنامه درسي دانشجويان رشته هاي:

داروسازي

پزشكي

كشاورزي

گياهشناسي

زيست شناسي

جنگلداري و …. درآمده است.

تاريخچه

اولين بار در سال 1838 اشليدن و شوان تئورييك Totipotency را ارائه نمودند.

براساس اين تئوري ، هر یک از سلولهاي يك موجود پرسلولي اگر در شرايط مطلوب محيطي قرار بگيرند.

توانائي تكامل و تبديل شدن به يك موجود كامل را دارند.

بعدها اين تئوري به عنوان اساس مطالعات در زمينه كشت بافت قرار گرفت.

اساس تئوري كشت بافت گياهي توسط هابرلنت فيزيولژيست شهير آلماني در سال 1902 پيشنهاد گرديد.

مطالعه سيستماتيك سازمان يافته اي روي كشت سلولهاي رويشي ايزوله شده گياهان عالي انجام نشده است.

او بر روي سلولهاي ايزوله فتوسنتزي برگ و سلولهاي متفاوت ديگر آزمايش كرد كه ناموفق بود.

با اين وجود اظهار داشت كه مي توان به طور موفق جنين هاي مصنوعي حاصل از سلولهاي رويشي را كشت كرد.

 

 نظريه توتي پتانسي را بيان نمود و نشان داد:

 

تكنيك كشت سلولهاي ايزوله گياهي در محلول غذايي، روش آزمايشي جديدي براي بررسي مسائل مهم است.

براساس تحقيقات او در سال 1902 (و بعد از آن) ، هابرلنت به عنوان پدركشت بافت گياهي نام گرفت.

پس از آن در سال 1907 اولين كشت سلولهاي حيواني و انساني انجام شد.

در كشت سلولهاي گياهي پيشرفتي وجود نداشت تا اينكه در سال 1955 هورمون كينتين كشف شد.

به دنبال اين كشف، كشت سلولها و بافتهاي گياهي رونق گرفت.

به طوري كه در سال 1958 تعداد آزمايشگاههاي كشت بافت گياهي در آمريكا و كانادا به بيش از 250رسيد

در هر آزمايشگاه سالانه بيش از يك ميليون گياه توليد مي گردد.

اين رقم در سال 1985 براي هر 18 آزمايشگاه سالانه به 60 ميليون گياه رسيد.

پيشرفت مهم ديگري كه در سال 1962صورت گرفت معرفي و توليد محيط كشت MS (موراشيگ و اسكوگ) بود.

اين محيط يكي از بهتري محيط هاي كشتي است كه امروزه نيز كاربرد دارد.

 

 تاريخچه كشت سلول و بافت مي توان به موارد ذيل اشاره نمود:

1902: اولين كوشش در كشت بافت گياهي توسط هابرلنت.

1904: اولين كوشش براي كشت جنين از بعضي گياهان خانواده شب بو توسط هانيگ.

1922 : كشت درون شيشه نوك ريشه توسط رابين.

1934 : كشت موفقعيت آميز ريشه هاي گوجه فرنگي توسط وايت.

1936 : كشت بافت بازدانگان مختلف توسط دارو.

1939 : كشت موفق ومداوم كالوس توسط گوتره، نوبه كورت و وايت.

1950 : باززائي اندامها از بافتهاي كالوس درسكويا توسط بال.

1960 : تكثير رويشي اركيده به وسيله كشت مريستم توسط مورل.

1962 : توسط موراشيگ واسكوگ. ( MS ) توليد محيط كشت معروف موراشيگ و اسكوگ

1964 : توليد اولين گياه تا توره ها پلوئيد از كشت دانه گروه توسط گها و شوواري.

1969 : توسط اريكسون و Hapopappus اولين جداسازي موفق پروتوپلاست از كشت سوسپانسيون جانسن.

1974 : انتقال بيولژيكي در كشت بافت گياه توسط رين هارد.

1985 : آلودگي و انتقال قطعات برگ بوسيله اگروباكتريوم و باززائي گياهان انتقال يافته توسط هدرج و همكاران.

خصوصيات آزمايشگاه كشت سلول و بافت

تعيين محل آزمايشگاه كشت بافت، تصميم مهمي است.

آزمايشگاه نبايد در مجاورت آزمايشگاه هايي كه از ميكروارگانيسم ها و يا حشرات استفاده مي كنند.

محل ذخيره بذر و مواد گياهي هستند، تأسيس شود زيرا انتقال آلودگي از طريق دريچه هوا و رفت و آمد زياد، مسئله ساز مي گردد .

رفت و آمد زياد موجب بالارفتن غبار از كف زمين شده و به گسترش آلودگي كمك مي كند.

ازقراردادن گلدان حاوي گياه در فضاي آزمايشگاه كشت بافت اجتناب شود.

چون  منبعي از كنه ها و ساير موجودات آلوده كننده ديگر باشد.

بلافاصله بعد از پايان كار در مزرعه يا گلخانه، نبايد وارد آزمايشگاه شد.

زيرا احتمال ورود كنه و حشرات چسبيده به مو يا لباس به داخل آزمايشگاه وجود دارد.

تجهيزات آزمايشگاهي كشت سلول و بافت

تجهيزات و وسايل لازم براي يك آزمايشگاه كشت بافت به شرح زير است:

– اتوكلاو، از اين وسيله براي استيل كردن محيط هاي كشت و وسايل شيشه اي استفاده مي شود.

– مواد شيميايي، منظور محيط هاي كشتي است كه براي كشت استفاده مي شود.

محيط هاي كشت عموماً داراي عناصر ماكرو و ميكرو، ويتامين، هورمون ، قند و آگار مي باشد.

– دستگاه آب مقطرگيري ، آون (فور)، وسايل فلزي توسط اين دستگاه استريل مي گردد.

– اتاقك رشد يا Growth chamber ، در اين اتاقكها از لامپهاي آفتابي و مهتابي استفاده شده و دما طوري تنظيم مي گردد كه تا حدود 25 درجه سانتيگراد باشد.

Hot Plate Magnet – ،در تهيه محيط كشت از اين دستگاه استفاده شود.

– ترازوي حامل، حساسيت آن بايد از 001/0 باشد تا موادي بامقادير كم (مانند هورمونها) را نيز بتوان وزن كرد.

شيكر ، در كشت مايع از آن استفاده مي شود.

p H متر

مواد لازم براي استريل كردن جداكشت، محيط كشت و ابزار كار (شامل هيپوكلريت سديم و الكل اتيليك 70%)

– منبع گاز دستگاه لامينار

– يخچال و فريزر

اتاقك استريل (دستگاه لامينارايرفلو)

گرچه آماده سازي و قطع قلمه ها، قطعات كالوس و غيره، در يك ظرف شيشه اي و يا در بين فيلتر كاغذي استريل انجام مي شود، ولي انجام اين كار در اتاقك استريل ضرورت دارد.

هنگامي كه اعمال فوق در يك فضاي غيراستريل انجام شود.

ميزان آلودگي افزايش چشمگيري مي يابد، حتي اگر از كاغذ استريل جهت كار استفاده شود.

اتاقك استريل محلي است كه هواي مكيده شده از خارج قبل از ورود به آن ، با عبور از فيلترهاي بسيار ريز، تصفيه مي شود.

اين سيستم تصفيه جرياني از هواي استريل ايجاد مي نمايد.

همچنين به منظور ضدعفوني خشك از چراغ الكلي يا چراغ گازي استفاده مي شود.

كلياتي در مورد استريل كردن تجهیزات كشت سلول و بافت

استريل كردن شامل استريل مواد گياهي، محيط كشت و ابزار مورد مصرف در كشت سلول و بافت مي باشد.

در مورد مواد گياهي يا جداكشتها، ابتدا سطح اندامي كه قرار است به عنوان جداكشت استفاده شود را با مايع ظرفشويي شسته و به خوبي آب كشي كرده سپس جداكشت مورد نظر را تهيه و در محلول هيپوكلريت سديم (وايتكس) قرار مي دهيم.

باتوجه به نوع گياه و نوع جداكشت ، تيماري كه براي استريل كردن استفاده مي كنيم ، متفاوت است.

به اين معني كه رقت محلول هيپوكلريت سديم و زمان قرار دادن جداكشت در آن بسته به نوع گياه متفاوت است.

لازم به توضيح است كه جداكشت يا Explant را مي توان از تمام قسمتهاي يك گياه اعم از سيستم انتهاي ساقه، برگ، ساقه، ريشه و … بدست آورد.

از ديگر مواردي كه نياز به استريل كردن دارد، محيط هاي كشت مي باشد.

پس از تهيه محيط كشت دلخواه آن را در شيشه هاي درب دار ريخته و در اتوكلاو استريل نماييد.

توجه: درب شيشه هاي حاوي محيط كشت استريل تنها بايد هنگام كار در زير دستگاه لامينار(اتاقك استريل) باز شود.

استريل كردن ابزار كار نيز از جمله مواردي است كه بايد رعايت گردد.

ابزار فلزي مورد نياز از جمله دسته تيغ يا قيچي و پنس را داخل فويل آلومينيوم پيچيده و در آون با حرارت200 درجه سانتيگراد به مدت يك ساعت استريل كنيد.

ظروف پتري را نيز مي توان مشابه ابزار فلزي استريل نمود.

هورمون ها و برخي ويتامينها كه به دماي بالا حساس هستند را بعد از استريل شدن محيط كشت و در زير دستگاه لامينار با استفاده از فيلترهاي غشايي به محيط كشت اضافه نمائيد.

تيمارگرمائي ، Heat Therapy

تيمارگرما براي خلاصي از عوامل آلودگي در گياه استفاده مي شود.

يكي از مهمترين عوامل آلودگي، ويروسها مي باشند.

گياهان و ويروسها واكنش يكساني به تيمارگرمايي نشان نمي دهند

اما بايد تعادلي به وجود آيد كه هم به گياه اجازه رشد داده شود و هم بيشترين ميزان حذف ويروس را داشته باشيم .

همانطور كه مي دانيم در شرايط رشد طبيعي به موازات رشد انتهايي ساقه، ويروس نيز به بافتهاي جديد منتقل مي شود.

اگر گياه بتواند در درجه حرارتهاي بالا رشد كند، در اين صورت احتمال كاهش سرعت همانند سازي ويروس وجود دارد و در نتيجه انتهاي ساقه مي تواند سريع تر از ويروس رشد كرده و عاري از ويروس گردد.

سپس مي توان انتهاي ساقه را كه عاري از ويروس است، قطع و آن را كشت نمود.

دمايي كه معمولا استفاده مي شود 36 تا 37 درجه براي چند روز (تا 7 روز) در ماه است.

استفاده از برخي مواد شيميايي در محيط كشت نظير Ribavirin نيز منجر به توليد گياه عاري از ويروس مي گردد.

محيط كشت و تركيبات آن

انتخاب محيط كشت براي موفقيت در كشت بافت ضروري است .

هيچ محيط كشت مشخصي را نمي توان براي رشد انواع سلولها توصيه كرد .

اغلب لازم است تغييراتي در محيط كشت براي پاسخگويي انواع مختلف جداكشت صورت گيرد. مسير تعيين يك محيط كشت به هدف كشت سلول و بافت بستگي دارد.

به طور كلي محيط كشت حاوي نمك هاي غير آلي و تركيبات آلي مثل تنظيم كننده هاي رشد، ويتامينها، كربوهيدراتها و يك عامل ژله اي كننده محيط مي باشد، علاوه بر اين محيط كشت مي تواند داراي اسيد آمينه و آنتي بيوتيك نيز باشد.

– اجزاي محيط كشت سلول و بافت گياهي به شرح زير است:

الف) نمك هاي غيرآلي و مواد معدني:

براي رشد بافتهاي گياهي كشت شده ، تأمين مداوم بعضي از تركيبات شيميايي معدني در محيط كشت ضروري مي باشد.

كربن، هيدروژن، اكسيژن، فسفر، پتاسيم، كلسيم، منيزيم و نيتروژن به مقادير نسبتاً زيادي براي رشد و نمو بافتهاي گياهي ضروري مي باشد.

نيتروژن كه بيشتر از ساير عناصر مورد استفاده مي باشد به صورت نيترات يا يون آمونياك و يا تركيبي از آنها به محلول غذايي افزوده مي شود.

سولفات منيزيم نياز محيط كشت به دو عنصر منيزيم و گوگرد را تأمين مي كند .

فسفر را مي توان به صورت فسفات منوسديك و يا فسفات منو پتاسيك به محيط كشت اضافه كرد.

به منظور تأمين كلسيم مي توان از كلرور كلسيم يا نيترات كلسيم استفاده نمود.

به طور گسترده اي استفاده مي شود و هدف از تهيه اين محيط از فرمولاسيون موراشيگ و اسكوگ(MS) كشت آن است كه نشان دهيم اضافه نمودن عصاره بافت هاي گياهي.

رشد سلولي در كشت درون شيشه را افزايش نمي دهد و مواد غذايي غير آلي معادل، محدود كننده رشد سلولي نيستند.

 

ب) تنظيم كننده هاي رشد

تنظيم كننده هاي رشد ( يا هورمونها) تركيبات آلي هستند كه به طور طبيعي در گياهان عالي ساخته ميشوند و بر روي رشد و نمو اثر مي گذارند.

در كشت درون شيشه گياهان عالي، نقش تنظيم كننده هاي رشد  بارز مي باشد

در اغلب موارد كشت درون شيشه بدون حضور تنظيم كننده هاي رشد غير ممكن است .

بايد دانست اضافه كردن هورمون به محيط كشت بستگي به نوع قلمه و گونه گياهي دارد .

به عنوان مثال قلمه هايي كه خود اكسين كافي توليد مي كنند، به اكسين اضافي براي رشد و تقسيم سلولي نياز ندارند.

اكسين ها:

اين هورمون باعث رشد طولي سلول ، تقسيم سلولي ، تشكيل ريشه هاي نابجا و ممانعت از تشكيل شاخه هاي نابجا و جانبي مي گردد.

در غلظت هاي پايين اكسين، تشكيل ريشه هاي نابجا تحريك شده

در حاليكه در غلظت هاي بالاتر كالوس زايي تحريك مي گردد.

از مهمترين اكسين هائي كه به ميزان زيادي در كشت بافت استفاده مي شود ايندول بوتيريك اسيد (IBA) مي باشد.

اين اكسين در محيط كشت به موقع تجزيه مي شود.

ديگر اكسين هاي رايج مي توان از ايندول استيك اسيد يا IAA (زودتر از حد معمول در محيط تجزيه مي شود)

نفتالين استيك اسيد يا NAA (ديرتر از حد معمول در محيط كشت تجزيه مي گردد)

2 و 4 دي كلروفنوكسي استيك اسيد (– D 2 و 4 )براي القاي كالزايي و از و IBA ، NAA و IAA براي ريشه زايي استفاده مي گردد.

سيتوكنين ها:

كينتين، بنزيل آدنين(BA) زآتين، 2 ايزوپنتيل آدنين(ip2) از پر مصرف ترين سيتوكينين هايي هستند كه در محيط هاي كشت گياهي به كار مي روند.

اين هورمونها غالباً براي تحريك رشد و نمو به كار مي روند.

سيتوكينين ها در غلظت كم باعث توليد كالوس و در غلظتهاي بيشتردر ليتر، شاخه زايي را تحريك مي نمايند.

اسيد جيبرليك:

اين گروه شامل حدود 60 تركيب است كه GA3 رايج ترين آنها در گياهان است.

اسيد جيبرليك به ندرت دركشت بافت استفاده مي شود.

نقش اسيد جيبرليك عموماً در تحريك جوانه زني بذر و تحريك رشد طولي ميانگره هاست .

اين هورمون در محيط هاي كشت ، تحريك طويل شدن شاخساره هاي خيلي كوچك و تحريك تشكيل جنين روي كالوس مي باشد.

ABA اسيد آبسيزيك

اين تنظيم كننده يكي از مهاركننده هاي رشد محسوب شده اما در كشت بافت در تحريك نمو جنين از كالوس نقش دارد و از آن به ندرت در جنين زايي سوماتيك استفاده مي شود.

اتيلن:

از اين هورمون در كشتهاي invitro جهت جوانه زدن و تمايز سلولهاي چوبي استفاده مي شود.

ج) ويتامين ها

ويتامين ها نقش كاتاليزوري در سيستم هاي آنزيمي داشته و در محيط هاي كشت گياهي فقط به مقدار بسيار جزيي مورد نياز هستند.

مهمترين ويتاميني كه در محيط هاي كشت سلولي از آن نياسين استفاده مي شود(B1) می باشد.

برخي از ويتامين هاي ديگر كه در تهيه محيط كشت از آنها استفاده مي شود شامل نيكوتينيك اسيد يا نياسين(B3)، پيريدوكسين (B6)، اسيد آسكوربيك (Vit c)، اسيد فوليك و ريبوفلاوين (B2) مي باشند.

د) كربوهيدارتها

جداكشت ها از نظر فتوسنتزي فعال نبوده و به يك منبع كربن ( كه ساكارز يا گلوكز مي باشد) نياز دارند.

ه) عامل ژله اي كننده

اغلب آزمايشهاي كشت بافت برروي بستري ثابت صورت مي گيرد و به طور معمول از يك عامل مولد ژل جهت اين كار استفاده مي شود .

اين عامل مولد ژل مي تواند آگار ، ژلرايت  و يا فايتوژل باشد.

محيط هاي كشت معروف

بيش از 5 هزار محيط كشت ساخته شده است كه مهمترين آنها عبارتند از:

WPM ، MS(Murashige & Skoog1962), B5(Gomborg 1968), DKW(Driver Kuniyuki1984) (Lloyd & McCown 1981)
يا جداكشت explants تهيه گياهي كه از آن به عنوان جداكشت استفاده مي شود بايد سالم، بدون بيماري و آفت باشد .

گياهي كه خشبي نشده به كشت بهتر جواب مي دهد.

براي آنكه گياه به مرحله بلوغ برسد ، 3 مرحله را بايد طي كند:

1-نونهالی 2- انتقال یا بینابینی 3- بلوغ

از طرفي مسن شدن به دو گونه تعريف مي شود:

Cronological aging – مسن شدن سني

Physiological aging – مسن شدن فيزيولژيك

مسن شدن فيزيولوژيك در گياهان مختلف فرق مي كند. مثلاً در گياه گردو10 سال طول مي كشد تا پاجوش آن گل بدهد.

خصوصيات گياه در هر يك از3 مرحله بالا دو طي كشت بافت فرق مي كند. مثلاً اگرگياه در مرحله نونهالي باشد به راحتي ريشه مي دهد.

لازم به ذكر است هر چه سن گياه كمتر باشد و از قسمتهاي جوان گياه جداكشت تهيه شود، كشت بافت آن موفق تر است.

انواع كشت

1- culture Cell كشت سلول:

به كشت سلولها در محيط هاي مايع (بدون آگار) در ظرفهايي كه معمولاً باتكان دادن تهويه مي شوند، كشت سلولي گويند.

2- كشت پروتوپلاست :

به سلولهاي گياهي بدون ديواره سلولي، پروتوپلاست گفته مي شود.

از كشت پروتوپلاست براي ايجاد تغييرات ژنتيكي ، هيبريداسيون سلولي استفاده مي شود.

عليرغم وجود مشكلات تكنيكي كه استفاده از پروتوپلاست را در پاره اي از مطالعات محدود كرده است، در حال حاضر از پروتوپلاست در زمينه هاي تحقيقاتي متعددي به شرح زير استفاده مي شود:

الف- ايجاد پيوند پروتوپلاستي بين دو يا چند سلول و تهيه گياهان دورك با كشت پروتوپلاستهاي متحد شده،

در برخي مواردي كه به دليل ناسازگاري جنسي و يا فيزيكي امكان تهيه گياه دورگ با روشهاي ژنتيكي معمولي ميسر نيست مي توان با روش پيوند پروتوپلاست نسبت به ايجاد گياهان دورگ اقدام نمود.

ب- وارد كردن موادژنتيكي خارجي به داخل سلول پس از حذف ديواره سلولي، پروتوپلاست مجزاشده مي تواند با فرآيندي مشابه با فرآيند آندوسيتوز در بعضي از سلولهاي جانوري مواد خارجي را به داخل سيتوپلاسم جذب نمايد.

با استفاده از اين روش مي توان اندامك هايي مانند كلروپلاست ، ميتوكندري،DNA ، پلاسميد و … را وارد پروتوپلاست كرد.

ج- مطالعه نحوه سنتز و ترشح ديواره سلولي. پروتوپلاست كشت شده به سرعت ديواره سلولي تشكيل مي دهد.

3- كشت گرده و تخمك :

از اين روش براي توليد گياهان هاپلوئيد در شرايطinvitro استفاده می شود.

هدف از كشت بساك يا گرده توليد گياهان هاپلوئيدي از راه تحريك توليد جنين از تقسيمات دانه هاي گرده نابالغ مي باشد.

سلولهاي گياهان هاپلوئيد داراي مجموعه كاملي از كروموزمهاي تكي است .

كروموزمهاي منفرد اين هاپلوئيدها را مي توان با استفاده از كلشي سين به صورت دوبل درآورد و درنتيجه ديپلوئيدهاي هموزيگوت بارور توليد مي شوند.

با استفاده از كلشي سين گياه و درگیاه n2 را می توان n4 کرد.

4- كشت تك جوانه Single node:

منظور از كشت تك جوانه ، جداكردن يك جوانه به همراه قسمتي از شاخه به منظور تشكيل ساقه از طريق نمو جوانه است.

اين روش طبيعي ترين روش تكثير رويشي گیاهان در invitro مي باشد .

هر جوانه اي در محور برگ مشابه با جوانه نوك شاخه، مي توان روي محيط كشت رشد داده شود.

5- كشت رأس شاخه Shoot tip culture:

رأس شاخه يا قسمت انتهايي ساقه در واقع شامل هر سيستم انتهايي ساقه همراه با چندين پريمورديوم برگهاي مجاور مي باشد.

از اين روش براي تكثير در سطح وسيع استفاده مي شود.

6- كشت مريستم :

تنها نقطه اي در گياه كه عاري از آلودگي ويروسي است، مريستم مي باشد.

چرا كه سرعت و قدرت تقسيم در مريستم به حدي زياد است كه ويروسها فرصت تقسيم و رشد پيدا نمي كنند.

كشت مريستم عمدتاً در گياهان باغي مورد استفاده قرار مي گيرد هر چند براي تعداد زيادي از گياهان زراعي مثل سيب زميني ، شبدر و تنباكو نيز از اين روش استفاده شده است .

گياهان عاري از ويروس در برخي گونه ها مثل گيلاس ، تمشك و انگور نيز از طريق كشت مريستم به دست آمده است .

7-كشت اندام و بافت :

به كشت اندامها و بافتهاي مختلف گياهي نظير بساك، تخمدان، آوند، ريشه …. در محيط هاي مغذي گفته مي شود.

8-كشت كالوس يا (توده هاي سلولي تمايز نيافته) :

كشت قطعات جدا كشت گياهان بر روي محيط هاي حاوي آگار كه منجر به توليد توده هاي سلولي آمورف مي گردد را كشت كالوس گويند.

فرآيند ايجاد كالوس از يك قطعه گياهي كشت شده را مي توان به 3 مرحله تكاملي تقسيم كرد:

اول شروع تشكيل كالوس، دوم تقسيم سلولي، و سوم تكثير و تمايز سلولهاي كالوس. در مرحله تشكيل كالوس ، همزمان با آماده شدن سلولها براي تقسيم، متابوليسم سلولي افزايش مي يابد.

يكي از عمده ترين مشكلات استفاده از كشت كالوس، ايجاد تنوع مي باشد.

استفاده عمده كشت كالوس در جايي است كه بتوان سلولهاي كالوس را از هم جدا نموده و آنها را جهت تمايز به جنين هاي سوماتيكي القاء نمود.

از نظر ريخت شناسي اين جنين ها شبيه جنين هاي بذري (زيگوتي) مي باشند.

اما برخلاف جنين هاي بذري ، جنين هاي سوماتيكي از لحاظ ژنتيكي شبيه گياهان مادري مي باشند. يعني تفرق ژنتيكي وجود ندارد.

نكته جالب توجه در اين مورد، توليد بذر مصنوعي (سوماتيكي) مي باشد كه از طريق قرار دادن جنين هاي سوماتيكي در يك پوشش مناسب، تهيه مي شوند.

9-كشت جنين :

استعداد گياهان گلدار براي توليد جنين به تكامل سلول تخم بارور شده محدود نبوده بلكه در بافتهاي رويشي كشت شده اين گياهان نيز مي توان جنين ايجاد نمود.

اين پديده براي نخستين بار در و همكارانش گزارش شده است. امروزه كشت سوسپانسيون سلولهاي هويج توسط استوارد(Steward) معلوم شده است كه توليد جنين يك پديده عمومي در گياهان عالي بوده و در بافتهاي كشت شده بيش از30 تيره گياهي، توليد جنين از سلولهاي رويشي به طور تجربي ميسر شده است.

10- كشت جنين نارس :

كشت جنين نارس به دست آمده از بذور دو كاربرد اصلي دارد.

در بعضي موارد ناسازگاري بين گونه ها يا ارقام، بعد از تشكيل جنين اتفاق مي افتد و منجر به سقط جنين مي شود.

چنين جنين هايي را در حالت نارس و قبل از سقط شدن مي توان خارج كرده و در شرايط درون شيشه اي آنها را رشد داد.

در موارد ديگري ، به دليل ريزش بذر پس از رسيدن و از دست رفتن آنها، بذر بالغ ايجاد نمي گردد يا اينكه بذور در حال تشكيل قبل از بلوغ توسط حمله آفات از بين مي روند.

كشت جنين نسبتاً ساده است.

جنين، يك گياه كامل مينياتوري است لذا به تمايز مجدد نو ساقه يا ريشه نيازي نمي باشد.

(Regeneration) باززائي

تكنيك هاي كشت بافت گياهي به اندازه اي پيشرفت كرده است.

با اجراي آن مي توان گونه هاي گياهي را در شرايط درون شيشه باززائي و توليد نمود.

سلولها، بافتها و اندامهاي مختلف انتخاب شده ازگونه هاي گياهي متعدد را مي توان به طور موفقيت آميزي كشت كرد.

بدون باززائي ، مطالعات رشد و تمايز ، توليد گياهاني با اطلاعات ژنتيكي مختلف ، كشت بساك، تكثير سريع گونه هاي گياهي مطلوب ، حذف بيماريهاي گياهي با استفاده از كشت مريستم و بسياري از مطالعات مربوط به تنظيم كننده هاي رشد انجام پذير نخواهد بود.

باززائي و توليد گياهان توسط كشت بافت را مي توان به يكي از دو روش زير انجام داد:

1- رويانزائي سوماتيك، در اينجا اولين اصل، قطبي شدن سلول گياهي است.

به اين صورت كه تمامي واكوئل ها در يك قطب و تمامي ميتوكندريها در قطب مقابل آن قرار مي گيرند.

از قطب بالايي كه محل تجمع واكوئلهاست، شاخه و از قطب پائيني ريشه به وجود مي آيد.

جنين زائي مي تواند مستقيم يا غير مستقيم باشد.

در نوع مستقيم ، بدون تشكيل كالوس جنين زائي صورت مي گيرد.

در نوع غيرمستقيم، باتكشيل كالوس رويانزائي صورت مي گيرد.

2-اندامزائي، در اين روش گياه بدون جنين زائي به اندامزائي مي رود.

بايد دانست در كشت بافت اگر اندامي نظير ريشه يا شاخه به وجود آمد، اين اندام نابجاست چون از مريستم به وجود نيامده است.

توجه: قابل توضيح است كه رويانزائي سوماتيك با رويانزائي زيگوتي (تخمي) قابل مقايسه است.

به اين صورت كه در رويانزائي سوماتيك، رويان از سلولهاي پيگيري يا جسمي به وجود مي آيد نه از سلول تخم.

نوشته های مشابه

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

همچنین ببینید
بستن
دکمه بازگشت به بالا