مطالب آموزشی

PCR واکنش زنجیره ای پلیمراز

:PCR

واکنش زنجيره پلي مراز PCR يک روش آزمايشگاهي است که به منظور توليد انبوه قطعه خاص و انتخابي ازDNA به کار مي رود.

واکنش مبتني بر تکثير آنزيمي قطعه اي ازDNA است.

با استفاد از دو آغازگر چند نوکلئوتيدي که مکمل پايانهِ َ۵ هر دو رشته مورد نظر هستند، صورت مي گيرد تا کپي شدن الگوي

DNA توسط آنزيم پليمراز امکان پذير شود.

PCR از نظر اصولي عملي تشابه زيادي به همانند سازيDNA دارد.

در واقع برگرفته از آن است بطورکلي دو فرق بينPCR و همانندسازي وجود دارد:

همانند سازي در بدن در دمايc ۳۷با آنزيم DNA پلي مراز و آنزيمهاي ديگر صورت مي گيرد.

درPCRبه علت نياز به درجه حرارت بالا جهت واسرشت شدن از آنزيم مقاوم به حرارت همانندTaqاستفاده مي شود و به جاي

ساير آنزيمها ازتغييرات درجه حرارت استفاده مي شود.

 

● مقايسه تکثير ژن از طريق کلونينگ باPCR

 

▪ در کلونينگ هفته ها يا ماهها وقت براي تکثير قطعه DNA لازم است.

در حاليکه در PCR قطعات خاص DNA از ژنومي پيچيده، ظرف چند ساعت بدست مي آيد.

 

▪ درPCRمقادير بسيار کمي از DNA براي تکثير موردنياز است درحاليکه در روش هاي استاندارد کلونينگ وتجزيه وتحليل هاي

بيولوژي ملکولي به چند ميليون قطعه ازDNA احتياج است.

 

▪ براي کلون کردن،DNAتا حد امکان بايد خالص باشد ولي براي PCR خلوص DNA اهميت زيادي ندارد.

 

▪ تکثير DNA در PCR در محيط عاري از سلول صورت مي گيرد ولي کلونينگ به سلولهاي زنده نياز دارد.

 

▪ يکي از مزايايPCR سرعت آن است پليمراز Taqمي تواند توالي هايي متجاوز از هزارجفت باز را در ظرف مدت کمتر از يک دقيقه تکثير نمايد.

 

▪ درPCR نيازي به جدا کردن قطعه مورد نظر از محل استقرارش در DNA نمي باشدحاليکه اين محدوديت در روش هاي کلونينگ وجود دارد.

● اصول و مباني PCR

 

واکنش زنجيره پلي مراز مبتني بر تکثير آنزيمي قطعه اي ازDNA است.

با استفاده ازآغازگر صورت مي گيرد. طول آغازگر بايستي به اندازهِ کافي بزرگ باشد تا تواليهاي مشابه به آنها درنواحي غير هدف يافت نگردد پرايمرها دو عمل را انجام مي دهند.

اندازه قطعات تکثير شونده را مشخص مي کنند،محل ژني که بايد تکثير شود را مشخص مي کنند.

بعد از اتصال آغازگر به مکملهاي خود در توالي هدف، انتهاي هيدروکسيل َ۳ آنها رو به سوي ناحيه هدف قرار مي گيرد.

PCR طي سه دورهِ متوالي واسرشت سازي رشتهِ الگو، اتصال آغازگر و بسط توسط آنزيم پلي مراز انجام مي گيرد.

در چرخه اول و دوم فرآوردهِ حاصل از بسط داراي طول مشخصي نيست. در چرخه سوم قطعاتي ساخته مي شود که طول آنها

مشخص است از چرخهِ چهارم تکثير به صورت نمائي است

 

● استخراجDNA برايPCR

 

نقطهِ شروع بسياري از روشهاي بيولوژي مولکولي ضرورت جداسازيDNAبا کيفيت عالي است.

معمولا کيفيتDNA با عواملي از قبيل عدم آلودگي ناشي ازRNA، پروتئين، ليپيد و سايرساختارهائي که براي آنزيمهاي برشي و

پلي مرازها مزاحمت ايجاد مي کنند سنجيده مي شود.

روش هاي استخراج DNA  بايد حداقل استرس مکانيکي را در طي استخراج ايجاد نمايند.

معمولإ روش هائي که در آنها چندين شوينده همچون SDS وtritonX۱۰۰ استفاده مي شود.

که نقش آنها ليز نمودن سلول و کمک به از بين بردن پروتئين متصل بهDNA مي باشد.

پروتئين زدائي بيشتر از طريق پروتيئنازK صورت مي گيرد که اين ماده در بافر ليز کننده مورد استفاده قرار مي گيرد.

اين آنزيم در حضورSDSدر دمايc ۵۶-۶۵ فعاليت دارد تحت اين شرايط پروتئين بهتر واسرشت مي شود برعکس در همين شرايط

آنزيمهاي ديگر مثلDNAase دناتوره مي شود.

متعاقب استفاده از پروتيئنازKاز ايزوپروپانول براي از بين بردن موِثر پروتئين ها استفاده مي شود و باقيمانده پروتئين و ليپيد نيز

بطور موِثر از طريق کاربرد فنل و کلروفورم از بين مي رودآلودگيRNA از طريق تيمار کردن نمونه با RNAase از بين مي رود.

در روش هاي ديگر بعد از پروتئينازK از نمک اشباع براي رفع آلودگي پروتئين استفاده مي شود.

در استخراجDNA از هپارين برايPCR بهتر است استفاده نشود چون هپارين از فعاليتTaq پلي مراز جلوگيري مي کند.

وجود EDTA حداقلmM ۲ در بافر استخراج باعث مي شود که کوانزيمهاي آنزيمAase DN  باEDTA  شلات شود و از تجزيه

تصادفيDNA جلوگيري نمايد.

 

● پارامترهاي سيکلي

 

روشPCR بطوردستي (بوسيله حمام آبي) و هم بطور اتوماتيک و با ترموسايکلر صورت مي گيرد.

ابتدا با حرارت ۹۰-۹۴(در۳۰ ثانيه) دو رشتهDNA از يکديگر جدا مي شود.

سپس بامختصري برودتc ۳۰-۶۵بمدت (۳۰ثانيه) پرايمرها به مکملهاي خود درروي رشتهDNA متصل مي شوند.

به دنبال آن با رساندن دما به ۵۷-۷۰(۵-۲ دقيقه) شرايط براي گسترش پرايمرهاي چسبيده بوسيلهِ آنزيم تک پلي مراز فراهم مي شود.

زمان شيب حرارتي يا زماني که درجه حرارت از مقداري به مقدار ديگر عوض مي شود بستگي به نوع دستگاه به کار برده شده دارد

براي اطمينان از اينکه نمونه ها به درجه حرارت مورد نظر رسيده اند.

مدت زمان پرش حرارتي بوسيلهِ اندازه گيري ترمومتر نمونه درطي يک آزمايش تکثيرانجام مي شود .

گرماي غيرکافي درطي مرحله واسرشت يکي ازعلتهائي است که باعث شکست در واکنشPCR مي گردد.

 

● تعداد سيکلPCR :

● طراحي آغازگر:

 

قواعد مشخصي براي اينکه بتوان با اطمينان يک جفت پرايمر موِثر را انتخاب کرد وجود ندارد.

در حال حاضر پرايمر بيش از هر عامل ديگري عامل موفقيت يا شکست در يک واکنش تکثيري است.

بعضي قواعد راهنمايي هاي مفيدي را در مورد طراحي آغازگر مي کنند .

 

▪ طول متوسط هر پرايمر بين ۱۸- ۳۰جفت باز پرايمر با طول کوچک اتصال غيراختصاصي را افزايش و پرايمر بزرگتر سرعت

هيبريداسيون را کم مي کند

مقدارG-C دو پرايمر با هم مشابه بوده و حدود ۵۰-۶۰ درصد باشد.

 

▪ آغازگرها را بايد از نظر مکمل بودن با هم کنترل شوند.

 

پرايمر دايمر يا آغازگر دوتائي يک تکثير مصنوعي است که اغلب در محصولPCR مشاهده مي شود.

عبارتست از يک قطعهِ دو رشته اي که طول آن تقريبا به مجموع دو پرايمر نزديک است وهنگامي مشاهده مي شود که يک

پرايمر توسط آنزيم پليمراز به روي پرايمر ديگر گسترش يابدمکانيزم واقعي که چگونه پرايمر دايمر تشکيل مي شود بدرستي مشخص نيست.

پرايمرها با انتهاي مکمل َ۳ مستعد تشکيل دايمر هستند. ضعف در آنزيمTaq باعث پليمريزاسيون مستقيم الگوي غيرهدف شود.

در هر حال چنانچه پرايمر دايمر بعنوان مانعي مشاهده شوند مي توان آن را تاحدودي با غلظت حداقل پرايمر و آنزيم کاهش داد.

 

▪ در انتهاي َ۳ پرايمر بايد حداقلC ياGقرار گيرد در توالي هائي پرايمرهائي که انتهاي َ۳ آنها غني ا زG+C مي باشد احتمال اتصال

شتباهي افزايش مي يابد

 

▪ بايد تا حد امکان از تواليهاي پاليندروميک داخل پرايمرها جلوگيري کرد.

 

▪ نسبت چهار نوکلئوتيد در آغازگر حتي المقدور يکسان باشد.

 

▪ آغازگر به توالي تکرار شونده ختم نشود.

 

▪ دمايTm دو آغازگر نزديک هم باشد .

 

▪ حدمجاز دماي اتصال پرايمر طراحي شده بايد بين ۶۵-۵۵ باشد. دماي تکثيرايده آل ۶۲-۷۲مي باشد.

درجه حرارتي که پرايمر بهDNA الگو متصل مي شود به طول آغازگر و مقدارGC آن بستگي دارد.

براي پرايمرهاي حاوي GC ۵۰% و داراي ۲۰ نوکلئوتيد، دماي ۵۵ درجه سانتيگراد پيشنهادمي شود.

براي افزايش اختصاصي عمل کردن آغازگر حتي ممکن است دماهاي بالاتري هم موردنيازباشد.

براي اينکه هر پرايمر با رشته الگوي خودش هيبريد شود لازم نيست که عينا و کاملا مکمل رشتهِ الگو باشد.

براي طراحي پرايمر اغلب از برنامه هاي کامپيوتري ويژه استفاده مي شود.

فاصله بين پرايمرهايي که باDNAي هدف هيبريد مي شود بطور معمول کمتر از ۱۵ کيلو باز مي باشد.

در حقيقت يک کاهش اساسي در سنتز موِثر هنگامي که محصول تکثير متجاوز ا زb ۱۰۰۰مي شود، مشاهده مي گردد.

به همين دليل طول قطعه مورد تکثير درPCRنبايد بيش ازKb۳ باشد وحدمطلوب کمتر ازKb۱مي باشد تکثير قطعات بسيار طويل و

بالايKb ۴۰ مقدور است اما نياز به روشهاي ويژه اي دارد.

 

● دماي ذوب آغازگر

 

دماي اتصال بايد بقدر کافي پايين باشد تا پرايمر وDNA الگو قادر به اتصال باشند و از سوي ديگر بايد به قدر مناسب بالا باشد تا

از تشکيل اتصالات غيراختصاصي جلوگيري کند.

دماي اتصال از روي شاخصي به نام درجه حرارت ذوب محاسبه مي شود.

دماي ذوب درجه حرارتي است که درآن نيمي از DNAبه صورت تک رشته اي درآمده است.

يکي از مهمترين مشخصاتTm وابستگي آن به ترکيب بازيDNA استG. وC سه پيوند هيدروژني و بازهاي آدنين و تيمين

دوپيوند هيدروژني دارند.

بنابراين هر چقدر مقدار گوانين و سيتوزين درDNAبيشتر باشدTmبيشتراست. دماي ۲-۱ درجه سانتيگراد کمتر ازTmکافيست که

هيبريداسيون بين پرايمر وDNAي الگودر آن صورت گيرد.

دماي ذوب بطور معمول از طريق فرمول سادهِ زير نيز محاسبه مي شود.

c ۰Tm = ]۴ * (G + C) + ۲ * (A + T) براي هر پرايمر ۲۰ نوکلئوتيدي

دو پرايمر بايد طوري طراحي شوند که دارايTm يکسان باشند در غير اينصورت درحرارت مناسب براي يک پرايمر براي جفت ديگر

نامناسب خواهد بود.

بسياري از آزمايشگاهها دماي چسبيدن را از ۵-۳ درجه سانتيگراد زير دماي ذوب(Tm) که طريق اين فرمول محاسبه شده است

درنظر مي گيرند.

از اين موضوع نتيجه گرفته مي شود که پرايمرهاي با طول زياد باعث افزايش بالا رفتن اختصاصي بودن واکنش نمي شود.

بعضي از محققين رابطه زير را براي محاسبهTm پرايمر بکار مي برند.

(FA)= ۳۶/۰/L) – ۰۰۵(G + C) – ( ۱۱۴/۰ ]j+[ + ۰۱Log)۶/۶۱ + ۵/۱۸Tm

Kcl غلظت کاتيون منو و لنت=j

طول اليگو نوکلئوتيد=L

فرماميد که يک افزايندهِPCRاست=FA

بطور معمولPCR در غياب فرماميد انجام مي شود بنابراين مي توان آن را از آخر فرمول حذف کرد.

اين فرمول براي پرايمرهاي ۰۷-۴۱ بازي مناسب است.

فرمول ديگر براي محاسبهTm پرايمر براي نوکلئوتيدهايbp ۲۰-۳۵ مناسب مي باشدبصورت زير است.

(Ln)= ۶۴/۱ + ۲۲Tp

که در آن( G + C ) + ( A + T ) = Ln ۲ طول پرايمر وTPدماي مناسب اتصال اس

 

● غلظت پرايمرها و روش اندازه گيري آن

 

غلظت پرايمر بين ۵۰/۰ تا ۵/۰ ميکرومول و حد مطلوب ۶/۰ – ۱/۰ براي يک واکنش۲۵ ميکروليتري مي باشد.

غلظت بالاي پرايمر باعث بسط غيراختصاصي و پرايمر- دايمر مي شود.

 

● اتصال پرايمر

 

دما و مدت زمان لازم براي اتصال پرايمر به: ۱) طول پرايمر، ۲) ترکيب نوکلئوتيد۳) غلظت پرايمر بستگي دارد.

با توجه به طيف فعاليت آنزيمTaq پلي مراز که در محدوده ۵۸-۰۲ درجه سانتيگراد مي باشد.

دماي اتصال در محدودهِ ۷۲-۵۵ درجه سانتيگراد بطور معمول بهترين نتيجه را مي دهد.

افزايش دماي اتصال بسط غيراختصاصي را در انتهاي َ۳ پرايمر کاهش مي دهد.

دماي پايين تکثير همراه باغلظت اختصاصي بودن واکنش را کاهش مي دهد

 

● بسط پرايمر

 

مدت زمان بسط بستگي به عوامل:

۱) طول توالي هدف،

۲) غلظت توالي هدف

۳) دماي تکثير دارد. بسط پرايمر بطورمعمول دردماي ۷۲ درجه سانتيگراد انجام مي شود يک زمان بسط دقيقه اي در ۷۲ درجه

سانتيگراد براي فرآورده هاي معادل ۲ کيلو باز کافيست

 

● بافرPCR

 

متداول ترين بافر PCR که همراه با تک پلي مراز استفاده مي شود.

حاوي غلظت ۱۰ برابرکه قبل از استفاده بايد به نسبت (۱۰:۱) رقيق شود اين بافر حاوي اجزاي زير است.

براي يک واکنشPCR ، غلظتTris – Cl ،mM ۰۵-۰۱ مي باشد KClبا غلظت در حدmM۰۵را مي توان در مخلوط واکنش بمنظور

آسان شدن اتصال پرايمر به رشته الگو اضافه کردNaCl با غلظتmM ۰۵ ياKCl با غلظت بيش ازmM ۵۰ اثر باز دارندگي بر روي

فعاليت آنزيم تک پلي مرازدارند.

 

● غلظت منيزيم

 

غلظت منيزيم در تکثير اختصاصي و نيز فعاليت آنزيمTaq پلي مراز موِثر استPCR .

بايستي داراي ۵/۰ تا ۵/۲ ميلي مول منيزيم باشد حضورEDTAدر مقدار منيزيم اشکال ايجادمي کند.

غلظتMgCl۲ در مخلوط نهائي واکنش مي تواند متغير باشد معمولاإ ميزان بهينه آن درمحدودهِ ۵-۵/۰ ميلي مول است.

يون +۲Mgدو عمل انجام مي دهد:

اول اينکه باdNTPيک ترکيب قابل حل ايجاد مي کنند، دوم فعاليتTaq پلي مراز را تحريک مي کند.

معمولا کمبود +۲Mg باعث کاهش بازده و زيادي آن باعث تکثير غيراختصاصي مي شود.

آنجائي کهdNTP مي تواند به +۲Mgبچسبد، تعيين دقيق غلظت منيزيم به غلظتdNTP بستگي دارد .

در غلظت مناسب منيزيم و افزايشmM ۶-۴dNTP ،سرعت سنتز تک پلي مراز ۳۰-۲۰ درصدکاهش مي يابد.

 

● دي اکسي نوکلئوزيدتري فسفاتها(dNTP)

dNTP به دو صورت منفرد يا مخلوطي از چهارdNTPتهيه مي شودpH .

اکثر محلولهاياستوک باNaOHبه ۵/۷ رسانده مي شود.PCRمعمولا با غلظت حدود ميلي مول،dNTP۱۰۰ انجام مي گيرد.

اما غلظت مناسبdNTP بستگي به غلظتMgCl۲ ، غلظت پرايمر، طول محصول تکثير شده و تعداد سيکلهايPCR دارند.

محلولهاي پايهdNTP در ۲۰- درجه سانتيگراد نگهداري مي شود.

اين محلولهاي پايه dNTP بايد تا ۷pH=خنثي شود و از طريق اسپکتوفتومتر تعيين غلظت شوند.

در کارهاي مولکولي توصيه مي شود که در محلول کار، از هرdNTPيک ميلي مول موجودباشد براي به حداقل رساندن خطاها

هرنوعdNTP بايد درغلظت هاي مساوي بکاربرده شوند

يعني از علل بسط غيراختصاصي غلظت کمتر از يک ميکرومولdNTP يا غلظت کم يکي از بازها است.

ترکيب دماي بالا بسط و اتصال بالاي ۵۵ درجه و غلظت پايين ۵۰-۱۰ ميکرومولdNTP باشد.

باعث بيشترين دقت در فرآوردهِ نهاييPCR مي شود

 

● آنزيمهاي پلي مراز

DNA پلي مرازها آنزيمهائي هستند که با استفاده از منومرهاي دي اکسي نوکلئوزيدتري فسفات و با الگو قرار دادن رشته اصلي

ساخت زنجيره پلي نوکلئوتيدي را تسريع مي کنند.

ساخت DNA معمولا از جهت َ۵ بطرف َ۳ است، زيرا پلي مريزاسيون اغلب از ۵ آلفا فسفات دزکسي نوکلئوتيد تري فسفات بطرف پايانهِ ۳ گروه هيدروکسيل رشتهDNA استDNA .

پلي مراز برخلاف RNA پلي مراز نياز به قطعهDNA کوچک يا پرايمر براي چسبيدن به توالي مکمل دارد.

DNA پلي مرازها قادر به تکثير قطعاتي با حداکثر ۰۰۴ جفت باز مي باشند.

در دماهاي بالاعلت حساس بودن اين آنزيم نسبت به دما بايد مرتباإ پليمراز جديدي اضافه شود.

اين نحوه عمل سرعت و دقت عمل را پايين مي آورد.

 

● DNA پلي مراز

 

حسن اين نوعDNA پلي مراز درجه حرارت بالا (۵۹-۰۹ درجه سانتيگراد) آن است.

علاوه بر اين آنزيم تک مي تواند قطعاتDNA به طول ۱۰ هزار جفت را تکثير کند.

استفاده ازDNA پليمراز مقاوم به حرارت حاصل از باکتري ترموس آکواتيکوس که منشاءچشمه آب گرم پارک ملي يلواستون مي

باشد.

باعث ساده و خودکار شدن واکنش مي شود.

پلي مرازهاي مقاوم در برابر حرارت موجب شده اند که بسط اختصاصي فرآورده PCR بخاطر اتصال وبسط آغازگر در دماي بالا

افزايش يابد.

دماي مناسب براي فعاليت اين آنزيم با توجه به الگويDNA ، برابر ۸۰-۷۵ درجه سانتيگراد است.

در دماي ۰۷ درجه سانتيگراد بيش از ۶۵ نوکلئوتيد در ثانيه پلي مريزه مي شود.

 

● غلظت آنزيم

 

غلظت توصيه شده براي تگ پلي مراز بين ۵/۲-۱ واحد در صد ميکرو ليتر واکنش توصيه شده است.

در صورتيکه غلظت آنزيم بسيار بالا باشد، فرآورده هاي زمينه اي غيراختصاصي افزايش مي يابد و پايين بودن بيش از حد غلظت

نيز باعث کم شدن فرآورده هاي مورد نظر مي شود.

براي تکثيرDNAژنومي يک غلظت بهينه ازTaqمعمولا حدود ۴-۱ واحد درصد ميکرو ليتر واکنش توصيه مي شود.

 

● اختصاصي بودن واکنش

 

آنزيم مناسب و کنترل عواملي از جمله غلظت آنزيم، غلظت قطعات آغازگر،

همانندسازي درجه حرارت دقيق و زمان نگهداري محيط عمل در يک درجه حرارت معين و تعداد چرخه در هرآزمايش همه در

اختصاصي بودن واکنش اثر مي گذارند.

بطور کلي عواملي که در کارآييPCR ايفاي نقش مي کنند عبارتند از:

غلظتMgCl۲ ، کيفيت و کميتDNA الگو، بافرPCR، غلظتdNTP ، افزاينده هايPCR ،بازدارنده هايPCR ،Nested PCR،PCR با

شروع داغ، تعداد سيکلPCR و دماي اتصال پرايمر

 

● مهار کننده ها و افزايش دهنده هايPCR

 

مواد ليست شده در جدول ذيل مي توانند درPCR حاوي نقش باشند.

ژلاتين يا آلبومين سرم ۱۰۰ نانوگرم در ۵۰ ميکروگرم واکنش فرماميد ۵%، دي متيل سولفوکسايد (DMSO) ۰۱-۲% پيروفسفاتاز

واکنش واحد ۱۰۰/۰ – ۰۱، تترامتيل آمونيوم کلرايد (TMAC) ۰۰۱-۰۱ ميکرومول پلي اتيلن گلايکول ۰۰۰۶ ۵۱-۵ درصد، گليسرول

۵-۱ درصد، توين ۰۲ ۵/۲-۱ درصد، پروتئين ژن ۲۳ ۲ نانومول ، ۷ دي اَز – َ۲ dGTP- با ۵۷% جايگزين ، پروتئين تک رشته DNA

1  واحد، کلي باسيل ۱ واحد، بتائين ۵ ميکروگرم در ميلي ليتر، ژلاتين يا آلبومن سرم حيواني به غلظت ۱۰۰ ميکروگرم بر ميلي

ليتر و شوينده غيريوني مانندتوين ۰۲ يا Laurth-۲۱ (۱/۰ تا ۵۰/۰) درصد براي ثبوت پايداري آنزيم اضافه مي شود.

DMSO ساختمان ثانويهDNA هدف را کاهش مي دهد. آزمايشات نشان داد.

بطور سطحي اثر بازدارندگي بر رويTaq داشته و باعث کاهش بازده کل شده است. شوينده هاي غيريوني نظيرTritonX۱۰۰ و

توين ۲۰ تا غلظت ۵% مهار کننده نيست شوينده هاي يوني مانندسديم دودسيل سولفات(SDS) فقط در غلظت هاي بسيار

پايين قابل تحمل است و اين شوينده باروش استخراج فنل و رسوب اتانل قبل ازPCR ازDNA حذف مي شود.

SDS در غلظت ۲-۱ درصد استفاده مي شود در حاليکهTaq پلي مراز در غلظتهاي بالاتر.

۱ر۰درصدSDS مهار مي شود.Taq پلي مراز به عمل هضمي پروتيئنازK حساس است،

بنابراين پروتيئنازK بايستي حذف يا غيرفعال شود.

دماي ۵۹ درجه سانتيگراد براي رسيدن به چنين هدفي کفايت مي کند.

تيمار کردن حرارتي و سپس استخراج بوسيلهِ فنل پروتيئنازK را واسرشت مي کند.

آثار باقيماندهِ فنل مي تواندباعث مهارPCR شود که توسط کلروفورم حذف مي شود.

 

● شروع داغ

 

چنانچه لازم باشد تعداد زيادي نمونهِPCR آماده گردد.

ايجاد شرايط يکنواخت و مساوي براي هر تيوپ مشکل است.

علاوه بر اين باز و بسته کردن تيوپ براي انجام نمونه برداري هاي مختلف باعث مي شود که خطر آلودگي بالا رود.

بنابراين اجزاي واکنش را بطور فيزيکي با ماده اي که بعنوان مانع بکار برده مي شود مي توان جدا کرد.

هنگاميکه اين ماده در حين بالا رفتن دما ذوب مي شود آن ماده عاملي براي مخلوط شدن تمام اجزاي واکنش بطور همزمان در

زمان شروع PCR  مي باشد.

 

به عنوان مثال در اين تکنيک اجزاي ترکيب شوندهPCR به جزDNAپلي مراز و الگويDNAبا همديگر مخلوط مي شوند.

سپس يک عدد آمپلي واکس به مخلوط اضافه مي شود که در۸۰-۷۵ درجه به مدت ۱۰-۵ دقيقه ذوب مي شوند.

سپس اجازه داده مي شود که قطعه مومي خنک و به حالت جامد درآيد و اجزاي باقيمانده واکنش که شاملDNA پلي مراز و

الگويDNA و بافرمي باشد بر روي قطعه مومي اضافه و تيوپها در ترموسايکلر قرار داده مي شوند.

اگر ما موم را ذوب کنيم، اجزايPCR به همديگر مخلوط مي شود و موم به سمت بالا و در سطح مايع قرار مي گيرد.

پس از اتمامPCR تيوپها در دماي زير ۳۵ درجه خنک مي شوند و موم به حالت جامد در مي آيد.

 

● PCR آشيانه اي

PCR آشيانه اي يکي از راههاي افزايش دقتPCR مي باشد. در اين روش از دو نوع پرايمر استفاده مي شود.

ابتدا پرايمر اول اضافه مي شود و باعث تکثير قطعاتي ازDNA مي شود که احتمال دارد به ميزان دلخواه اختصاصي نباشد.

سپس پرايمر دوم اضافه مي شود که خصوصيات آن تکثير قسمت داخلي تر يا بعبارت ديگر اختصاصي تر مي باشد.

در واقع جفت پرايمر دوم پرايمرهائي هستند که داخل جفت اوليه هستند و قطعات طويلتر بوسيله اولين دورP CRتوليد مي شوند

به عنوان يک الگو برايPCR دوم بکار مي روند.

 

● اثر فلات

 

کاهش سودمندي تکثير و رسيدن به يک سطح ثابت تکثير در نتيجه کاهش مقدار آنزيم سيکل هاي بعدي را در اصطلاح اثر فلات

در واکنش تکثيري گويند.

اين فلات درPCR باTaq خيلي ديرتر از واکنش که با آنزيم کلنو انجام مي شود تشکيل مي شود و بطورکلي اختصاصي بودن

واکنش راافزايش مي دهد.

 

● آلودگيهايPCR

 

در عملPCR بايد از تکثير آلوده کننده هايي مانندDNA هاي تکثير شده در آزمايشهاي قبل جلوگيري به عمل آيد.

منابع زيادي براي آلودگيPCR وجود دارد .

 

● منابع بالقوه آلودگيPCR

 

هود و تهيه فيلترها ، دستگاه الکتروفوژ، لوله هاي سانتريفوژ، وارد کردن نوک پپيت به ژل،ترموسايکلر، بلوک هاي حرارتي،

روشهاي جمع آوري نمونه، آب يا سيستم خنک کننده، محيط آزمايشگاه، پرسنل آزمايشگاه، دستگاه هموژنيزه کننده بافت

 

● منابع بالقوه آلودگي

 

براي جلوگيري از آلودگيPCR آزمايشات بايد در هود ويژه يا حداقل قسمتي از آزمايشگاه صرفا به اينکار اختصاص داده شده قرار گيرد.

تجهيزات و محلولهائي که مرتب درPCR کاربرد داردبايد تحت نگهداري ويژه باشد هر ماده که قابل اتوکلاو کردن است.

بايد استريل شود و از دستکش در تمام مراحل PCR استفاده کرد و همچنين عينک و روپوش آزمايشگاهي نيز لازم است.

محلولهائي مانند بافر وdNTP بايد در سيستمهاي بسته نگهداري شود.

براي جلوگيري از آلودگي محلول پايه را بايد به چندقسمت تقسيم نمود.

در ذيل بعضي از روشها که مانع آلودگي مي شود ذکر شده است

 

▪ اوراسيل – ان – گليلوسيلاز (اين آنزيم محصولات قبليPCR را از بين مي برد.

 

▪ اشعه ماوراء بنفش

 

▪ تيمار آنزيمي

 

▪ مدت زمان واسرشت شدن

 

▪ درجه حرارت واسرشت شدن

 

▪ تعداد چرخه

 

▪ استفاده ازdUTP به جايdTTP

 

● روغنهاي معدني

 

روغن هاي معدني سبک براي پوشاندن مخلوطPCR و جلوگيري از تبخير به کار مي روند.

بطور کلي حدود ۶۰-۴۰ميکروليتر از روغن به ۱۰۰ ميکروليتر از محلولPCR اضافه مي شود.

روغن همچنين از آلودگي نمونه ها جلوگيري مي کند چنانکه سرپوش ترموسايکلر گرم شود.

احتياجي به پوشش با روغن نمي باشد روغن را با پيپت يا استخراج با کلروفورم براحتي مي توان خارج ساخت .

نوشته های مشابه

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

دکمه بازگشت به بالا